Gatekeepers 21 está ambientada en el siglo XXI, 32 años después de la serie original. En esos 32 años, la Tierra se libera finalmente de los invasores. Japón es próspera como nunca antes había sido. AEGIS todavía existe a menor escala para investigar sobre la existencia de más invasores y la mecánica de la puerta. Sin embargo, el de AEGIS network y la Academia de Defensa de la Tierra detectan enormes cantidades de infiltración alienígena en la sociedad humana. Bajo estas circunstancias, un grupo de élite de Cazadores de Invasores, integrado por Ayane Isuzu y Miu Manduru como sus dos primeros miembros.
Después de haber sufrido numerosas guerras interestelares, la humanidad por fin se ha unido. Sin embargo aún hay muchas disputas y guerras entre los mismísimos miembros de la unión. Para resolver estas disputas, se crea una organización secreta conocida como GOTT ("Galactic Organization of Trade and Tariffs", lo que viene a significar "Organización Galáctica de Comercio y Tarifas"), que se dedica a entrenar agentes con poderes especiales para mantener el orden. Los agentes Eclair y Lumiere son dos chicas con asombrosas habilidades, que son asignadas como compañeras. Juntas, a medida que van luchando, van descubriendo más y más sobre la organización para la que trabajan. Al final, nada es lo que parece...
Al vencer al líder del Comité de Moral Pública, Myouri Unzen, Medaka ha puesto en marcha un proyecto que el director de la Academia Hakoniwa esperaba con ansias: El Plan Probeta. Bajo este plan, el director intenta manipular a Medaka para que cumpla sus objetivos enfrentando al Consejo Estudiantil contra la Clase 13. Un grupo de individuos que se hacen llamar Anormales.
La historia toma lugar en un mundo donde ciertos individuos poseen un poder llamado "Incomprehensible Skill of Human beings"(ISH), dándoles súper poderes. Uno de esos individuos es Todoki Amane, una chica sencilla y cabeza hueca quien trabaja como una Idol mágica para una compañía teatral llamada Nought. Amane tiene una hermana gemela llamada Lilianne, quien nació sin un cuerpo. A diferencia de Amane, cuyo ISH es sumamente débil, Lilianne es extremadamente poderosa y es capaz de darle su poder a su gemela quien lo usa durante sus shows. Amane y Lilianne tratan de demostrar que el ISH es divertido mediante sus espectáculos, pero todo cambia cuando un grupo secreto de investigación llamado IAM trata de aprovecharse de Amane.